當?shù)孜锇l(fā)生化學反應(yīng)而產(chǎn)生的能量以光的形式釋放出來的時候，我們稱這個過程為化學發(fā)光。魯米諾（luminol）是zui常用的化學發(fā)光試劑之一，被過氧化物氧化后它會產(chǎn)生一種激發(fā)態(tài)的產(chǎn)物——aminophthalate。這種產(chǎn)物衰變至低能態(tài)的同時釋放出光子。添加物可以提高魯米諾反應(yīng)的發(fā)光強度和持續(xù)時間以及靈敏度。
    化學發(fā)光底物被廣泛使用是因為其具有其他檢測方法不具備的優(yōu)點，這些優(yōu)點使得化學發(fā)光成為大多數(shù)蛋白實驗室的檢測方法。使用化學發(fā)光可以通過多次曝光獲得的成像結(jié)果。還可以將檢測試劑*去除，再對其他目的蛋白進行檢測并成像，或?qū)z測條件進行優(yōu)化。具有很寬的線性響應(yīng)范圍，從而可以檢測并定量很寬濃度范圍的蛋白質(zhì)。zui重要的是，化學發(fā)光在所有的檢測方法中具有zui高的靈敏度。使用辣根過氧化物酶標記的抗體和G-Biosciences公司的femtoLUCENT™ PLUS （貨號 # 786-003），可以檢測的下限為飛克級，而這得益于這種底物中的增強劑可以很大程度地增強發(fā)光強度并提高靈敏度。
     化學發(fā)光底物與其他底物不同之處在于只有在酶和底物發(fā)生反應(yīng)的時候才會產(chǎn)生瞬時的可被檢測的光。這與那些可產(chǎn)生穩(wěn)定有顏色產(chǎn)物的底物不同；些有顏色的沉淀在酶-底物反應(yīng)結(jié)束之后仍然存在于膜上。在化學發(fā)光免疫印跡中，底物是反應(yīng)限制試劑。一旦其耗盡，光就會逐漸變?nèi)醪⑾?。實驗中一定要使用適當稀釋濃度的抗體，這樣才會在幾小時內(nèi)產(chǎn)生穩(wěn)定的光信號輸出，從而維持蛋白檢測的一致性和靈敏度。當抗體沒被足夠稀釋時，永遠不會獲得穩(wěn)定的光信號輸出。系統(tǒng)中太多的酶會快速氧化底物并終止信號。

化學發(fā)光，魯米諾在HRP和雙氧水存在的條件下會被氧化形成激發(fā)態(tài)的產(chǎn)物（3-aminophthalate）。3-aminophthalate在衰變至基態(tài)的過程中會發(fā)出波長為425nm的光。

femtoLUCENT™ PLUS

化學發(fā)光的優(yōu)點